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[의학,약학] [분자생물학] DNA 염기서열 분석방법

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작성일18-04-16 23:17

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`고전` 이라고는 하나 여전히 정확도나 Read Length 면에서 Sequencing의 Gold Standard 로 통하며, Genomics 쪽에서의 활용도는 아무래도 줄어들겠지만 일반적인 연구용의 Sequencing 방법으로써는 여전히 건재하다. Sanger method는 고전적인 염기 서열 분석 방법으로 약 30여년간 Sanger method는 DNA염기서열 결정 방법의 표준이 되어 왔다. 유전자를 구성하고 있는 4개의 염기 (A, T, G, C)에 각각 다른 형광표지를 붙여 실시간으로 유전자의 염기서열을 밝혀내는 기술로 Enzyme cascade(효소연쇄반응)를 응용, 나타나는 빛을 검출하여 데이터화 한다. , [의학,약학] [분자생물학] DNA 염기서열 분석방법의약보건레포트 , [의학 약학] [분자생물학] DNA 염기서열 분석방법



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PTP well에 준비된 emPCR비드와, 염기서열 분석에 필요한 각종 효소를 수반하는 Enzyme bead를 채워줌으로써 시료 준비가 완료된다. 서열을 분석할 DNA의 단일가닥 부위가 주형(template)으로 사용되며 dideoxyNTP를 이용하여 chain을 termination시켜 DNA 사슬의 연장을 특이적으로 종료시키는 기술이다.
하지만 Sanger method는 Human Genome Project와 같은 광범위한 염기서열 분석에 사용하기에는 극복하기 어려운 시간 및 비용의 한계를 지니고 있었다.
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[의학,약학] [분자생물학] DNA 염기서열 분석방법
분자생물학자들이 수행하는 가장 중요한 기술은 DNA 조각을 정확히 염기 배열하는 DNA 염기서열 결정법일 것이다.
그 중 대표적인 방법이 영국의 F. Sanger가 개발한 사슬 종결법(chain termination method)이다.
이 기술은 DNA 합성 기작에 그 기초를 둔다. DNA elongation에 dNTP 이용시 생성되는 PPi를 ATP sulfurylase


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다. Read Length 가 다른 방법에 비해서 상대적으로 길어 다양한 연구에 사용이 가능하지만, 한번 운용하는데 사용되는 비용이 Solexa나 SoLiD에 비해 굉장히 비싸다는 단점 또한 가지고 있다아

- Pyrosequencing의 과정
그렇다면 이러한 Pyrosequencing은 어떤 과정을 통해 이루어질까?
Pyrosequencing은 전체 genome을 염기서열 분석을 수행하기에 적당한 크기로 잘라주는 DNA Library preparation 과정과 emulsification을 통해 수백만 개의 미세반응계(micro-reactor)들을 만들고 이로부터 clonal DNA library를 만들기 위한 emPCR 과정 그리고 만들어진 clonal DNA들에 대하여 염기서열 분석 반응을 수행하는 Sequencing 과정으로 이루어진다. 즉, Library preparation 과정과 emPCR을 통한 Template preparation 과정을 통해 시료를 준비하고 이를 Sequencing 한다.
Sanger법과 달리 ddNTP를 사용하지 않고 DNA를 합성하는 동안 생성되는 부산물인 Pyrophosphate(PPi)를 사용한 기술로 “sequencing by synthesis 원리를 기초로 한 염기서열 분석방법이다.


- Pyrosequencing의 원리
준비된 시료를 이용하여 염기 서열을 Sequencing 한다. DNA 염기서열 결정법은 30여 년간 발전 및 이용되어왔으나, 1970년대 후반에 들어서야 빠르고 결과 적인 염기서열 결정이 가능케 되었다. 이러한 비용절감 및 빠른 시간에 대한 요구에 의해 Solexa, SoLiD, Pyrosequencing과 같은 여러 가지 차세대 염기서열분석 기술이 등장하게 되었다.
특히 Pyrosequencing은 read length가 가장 길고 소요되는 시간이 가장 짧아 적은 양으로 빠른 시간에 sequencing이 가능한 advantage(장점) 이 있어 최근 차세대 염기서열 분석 (Next Generation Sequencing)의 중심 기술로 각광을 받고 있다아
Roche 그룹의 일원인(原因) 454 Life Science에서 개발한 염기서열 분석 기술로서 일반적으로 Pyrosequencing 이라 함은 454…(省略) Sequencing을 칭한다.

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