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[생명공학 Plasmid DNA preparation

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작성일18-04-16 23:36

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다음 단계는 DNA를 분리 하는 방법과 같다.
세포벽을 가지는 박테리아의 경우에는 먼저 lysozyme을 처리하여 세포벽을 분해 시키며 세포막은 detergent인 SDS를 처리함으로써 분해 시킨다.

(3) 실험 원리 :
Plasmid DNA를 정제하기 위해서 여러 가지 방법들이 사용되는데 공통적으로 다음의 세 과정- 미생물의 배양과 플라스미드 증폭 ; 미생물 수거와 cell lysis ; plasmid DNA 정제-을 거친다.
Chromosomal DNA가 plasmid DNA보다 훨씬 크며, cell lysate로부터 얻어지는 chromosomal DNA가 군데군데 잘려진 linear DNA인 반면에 plasmid DNA는 covalently closed circular DNA이다.

(4) 실험 재료 :


① Strain : Plasmid DNA【pBlue스크립트 SKⅡ(+)】


② LB (containing Ampicillin) broth
? Yeast extract 5 g/L
? BactoTrypton 10 g/L
? NaCl 10 g/L
? Ampicillin 100 ㎍/mL


③ Solution I (100 mL)

? 50 mM Glucose (MW〓180.2, 0.901 g)
? 25 mM Tris-HCl (pH 8.0) (MW〓121.1, 0.3 g)
? 10 mM EDTA (pH 8.0) (MW〓372.2, 0.37 g)
※ Solution I can be prepared approximately 100 mL, autoclaved & stored at 4℃.


③ Solution Ⅱ (100 mL)

? 0.2 M NaOH (MW〓40, 0.8 g)
? 1% Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 〓1 g


④ Solution Ⅲ (100 mL)

? 5 M Potassium acetate 60 mL (MW〓98.14, 29.44 g)
? Glacial acetic acid 11.5 mL
? DW 28.5 mL


⑤ TE buffer (100 mL)

? 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) (MW〓121.1, 0.3 g)
? 1 mM EDTA (pH 8.0) (MW〓372.2, 0.04 g)


⑥ Ethanol, 7











순서
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실험결과/기타


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다.
설명

(1) 실험 제목 : Plasmid DNA preparation

(2) 실험 목적 : Ampicillin에 대하여 저항성을 지닌 E. coli (XLI-Blue, Amp-r) 의 plasmid
DNA【pBlue스크립트 SKⅡ(+)】를 isolation 한다.
그리고 여기에 산이 첨가되면 변성된 chromosomal DNA는 헝클어진 상태로 다시 모아지고 되고 원심분리에 의해 뭉쳐지면 순수한 plasmid DNA만 상등 액에 남게 된다된다. RNA는 RNase에 의해 가수분해 되어 제거되고 최종적으로 순수한 DNA를 얻을 수 있다.
이 때문에 열이나 알칼리 처리 시, chromosomal DNA는 수소결합의 파괴로 인해 변성(denaturat…(생략) ion) 되지만 plasmid DNA는 원형을 유지하게 된다된다. 단백질들은 phenol과 chloroform을 처리함으로써 제거할 수 있다. SDS는 세포막을 분해 시킬 뿐만 아니라 단백질을 변성시킬 수 있어 핵산 가수분해효소들의 작용을 억제할 수 있다.
DNA를 분리하기 위해서는 일단 DNA가 세포 밖으로 유출되도록 세포벽 및 세포막을 분해 시켜야 하고, 이때 DNA 가수분해 효소들의 활성을 억제하는 조건에서 DNA를 분리해야 하며 단백질이나 RNA가 같이 회수되지 않도록 해야 한다.
Plasmid DNA의 정제는 chromosomal DNA와 plasmid DNA간의 크기와 구조의 차이에 기초를 둔다. DNA는 alcohol에 의한 침전으로 얻을 수 있다.

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